希望

Apr 19, 2024

Communications Biology volume 6、記事番号: 474 (2023) この記事を引用

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21 オルトメトリック

メトリクスの詳細

クライオ集束イオンビーム (クライオ-FIB) ミリング技術は、その場クライオ電子断層撮影 (クライオ-ET) による研究用に、凍結した天然試料のクライオラメラを作製するために開発されました。 しかし、対象となるターゲットの精度は依然としてアプリケーションを制限する大きなボトルネックの 1 つです。 ここでは、3D構造化照明蛍光顕微鏡（SIM）システムとアップグレードされた高真空ステージを組み込んで、効率的にターゲットを絞ったクライオFIBを達成することにより、HOPE-SIMと名付けられたクライオ相関光学電子顕微鏡（クライオ-CLEM）システムを開発しました。 Cryo-SIM の 3D 超解像度と当社の Cryo-CLEM ソフトウェア 3D-View を使用すると、ターゲット領域の相関精度は、その後のクライオ ラメラ作製に十分な 110 nm に達します。 我々は、HOPE-SIM システムを利用して、ミトコンドリア、HeLa 細胞の中心体、感染した BHK-21 細胞のヘルペスウイルス集合コンパートメントをターゲットとしたクライオラメラの調製に成功しました。これは、将来の in situ クライオ ET に対する HOPE-SIM システムの高い有効性を示唆しています。ワークフロー。

三次元 (3D) 細胞の超微細構造を明らかにすることは、生命を理解する上で重要なステップです。 近年、クライオ電子顕微鏡 (クライオ EM) はますます改良され、高分子複合体の高解像度 3D 構造を研究するために使用される主要な生物物理学的手法の 1 つになりつつあります。 さらに、クライオ電子トモグラフィー (クライオ ET) は、原子に近い分解能を達成できる可能性を備え、乱れのない細胞ランドスケープの高分子組織を視覚化するためのもう 1 つの強力なツールとして登場しました 2,3,4。 クライオETによってガラス化細胞の細胞内超微細構造を可視化するために、極低温条件下での集束イオンビームミリング（クライオFIB）を使用してガラス化細胞から薄いクライオラメラを調製し、細胞内の多くの刺激的な生物学的観察を可能にしました。 細胞骨格 5、6、7、8、9、小胞体 (ER)10、26S プロテアソーム 11 などの細胞小器官の三次元組織は、クライオ ET によって首尾よく解析されています。

対象となる特徴を見つけて特定することの難しさなど、cryo-ET の広範な応用を妨げるいくつかの制限があります 12。 低温相関光学および電子顕微鏡法 (cryo-CLEM)13、14、15、16、17、18 は、蛍光標識を利用して後続の低温 FIB のターゲットに向かってナビゲートすることにより、この問題を克服する効果的なアプローチであることが証明されています。ガラス化細胞の粉砕 14、15、16、17 または凍結水和切片のク​​ライオ ET イメージング 12、18。 通常のセルの厚さは 300 keV 電子の平均自由行程をはるかに超えていることを考慮すると、クライオ ET データ収集前にガラス化セルを約 200 nm の厚さに作製する必要があります。 したがって、ガラス化、低温蛍光顕微鏡法 (cryo-FM)、cryo-FIB、cryo-ET からなる一連の実験手順は、多くの部位特異的な in situ 構造研究の日常的なワークフローとなっています 12,19,20,21,22。 23. このワークフローには通常、低温蛍光イメージング用の低温ステージを備えたスタンドアロンの蛍光顕微鏡が必要です15、16、17、24、25、その後に低温走査型電子顕微鏡（低温SEM）が続きます。 クライオ FM 画像とクライオ SEM 画像の間の相関アラインメントが生成され、クライオ FIB ミリングのガイドに使用されます12、18、21、26。 さらに、特定の 3D 相関ソフトウェアを使用した相関アラインメントには、蛍光ビーズなどのクライオ FM とクライオ FIB の両方で画像化された特定の基準マーカーが必要です 21,27。 極低温広視野蛍光顕微鏡 13,21,22 または高解像度クライオエアリスキャン共焦点顕微鏡 (CACM) 12 を開発することで、このワークフローを実現するためのハードウェア実装が多数報告されています。

クライオ FM とクライオ FIB 間の相関精度と成功率は、クライオ FM の分解能によって制限され、さらに試料の変形、失透、氷の汚染の要因によって減衰します 7,21。 当社は以前、クライオ CLEM 用の独自の高真空光学プラットフォーム (HOPE)25 を開発しました。これは、統合型クライオホルダーと特定の真空チャンバーを利用して、クライオ FM イメージングおよびクライオ FM イメージング中の氷の汚染を最小限に抑え、試料の変形や失透のリスクを軽減します。標本の移送。 ただし、HOPE システムでは、対物レンズの開口数 (NA) が低く、蛍光ターゲットの Z 位置の情報がない広視野蛍光顕微鏡を使用しているため、相関精度が 1 ミクロンを超える限界があり、これを改善する必要があります。部位固有のクライオFIBミリングの成功率を向上させます。